抗生素是廣泛用于治療細(xì)菌感染的藥物，通過殺死微生物或阻止其生長發(fā)揮作用。據(jù)估計(jì)，抗生素藥物的全球使用量約為每年10萬至20萬噸。這些化合物中的大多數(shù)是通過人類和動(dòng)物的糞便或尿液原封不動(dòng)地排泄出來，在水體中被發(fā)現(xiàn)是污染物，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)水生生物產(chǎn)生不利影響?？紤]到自然環(huán)境中的行為決定了個(gè)體的健康、繁殖，甚至物種的生存，因此評(píng)估抗生素對(duì)水生動(dòng)物，尤其是魚類的行為反應(yīng)的影響是相當(dāng)重要的。為此，本文測試了不同種類的抗生素對(duì)斑馬魚行為的影響，以評(píng)估抗生素引發(fā)的水環(huán)境改變是否會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的行為模式發(fā)生變化。
1. 研究方法
本研究選用6-9個(gè)月的成年斑馬魚，來測量其暴露于6.25、12.5和25 mg/L濃度抗生素環(huán)境下的行為影響，實(shí)驗(yàn)選用了金霉素、環(huán)丙沙星和頭孢他啶三種使用廣泛的抗生素作為代表。研究使用的斑馬魚被保存在一個(gè)自動(dòng)循環(huán)系統(tǒng)中，將抗生素溶解在水中96小時(shí)，同時(shí)記錄和分析斑馬魚的探索行為、認(rèn)知行為、社交互動(dòng)和攻擊性行為。
測量內(nèi)容
1.1探索行為
將斑馬魚分別置于實(shí)驗(yàn)箱中，分析記錄以下行為參數(shù)：移動(dòng)距離（m）、移動(dòng)時(shí)間（s）、靜止時(shí)間（s），最后一個(gè)參數(shù)用來測量焦慮指標(biāo)。
1.2 Y型迷宮實(shí)驗(yàn)
在這項(xiàng)測試中，斑馬魚使用視覺線索來確定自己的方位，并從Y形迷宮中區(qū)分新舊手臂。Y迷宮測試由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組成，以評(píng)估對(duì)新穎性和空間識(shí)別記憶的反應(yīng)。Y迷宮隨機(jī)開始起始臂，魚開始探索。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，魚只能探索兩條手臂，第三條手臂閉合。在第二次實(shí)驗(yàn)中，魚被放回同一個(gè)起始臂上，可以自由接觸所有三條手臂。
1.3 社交互動(dòng)行為
社交互動(dòng)用來測量斑馬魚的社會(huì)行為。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每條魚都被放在一個(gè)裝有水的實(shí)驗(yàn)池中。實(shí)驗(yàn)水池的一側(cè)放置了一個(gè)空的魚缸，另一側(cè)則裝有一個(gè)大小相同的水池，里面有15條斑馬魚。實(shí)驗(yàn)箱分為三個(gè)區(qū)域，“刺激區(qū)"靠近裝有斑馬魚的“刺激箱"，中間區(qū)域被視為中性，其余區(qū)域更靠近空箱。測量斑馬魚在每個(gè)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間，以分析魚類的社交行為和對(duì)同類的偏好。測量參數(shù)為斑馬魚在每個(gè)區(qū)域花費(fèi)時(shí)間的百分比，和到刺激區(qū)的平均距離（m）。使用Noldus的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)對(duì)斑馬魚行為進(jìn)行視頻記錄。
動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT) 是一款應(yīng)用廣泛的視頻跟蹤軟件，可以跟蹤和分析任何動(dòng)物的行為、運(yùn)動(dòng)軌跡和活動(dòng)。系統(tǒng)可以提供大量參數(shù)，以幫助對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深入分析，包括行進(jìn)距離、在某個(gè)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間、位置、路徑形狀以及更多相關(guān)參數(shù)。結(jié)果可以通過圖表，圖形，軌跡熱像圖等多種方法進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。
1.4攻擊行為
攻擊行為對(duì)物種維持群體、社會(huì)等級(jí)和交配等有影響。在攻擊性測試中，每條魚被分別放在一個(gè)實(shí)驗(yàn)池中，一個(gè)鏡子放置在水箱側(cè)面，與后壁成一定角度。當(dāng)一條測試魚游到魚缸的左側(cè)時(shí)，它們的鏡像看起來更接近它們。將魚缸分成四個(gè)相等的部分，并允許計(jì)算每個(gè)部分花費(fèi)的時(shí)間。進(jìn)入最左邊的區(qū)域（1區(qū)和2區(qū)）的時(shí)間表明傾向于接近“對(duì)手"，而進(jìn)入最右邊的區(qū)域（3區(qū)和4區(qū)）則表明攻擊性較小。使用EthoVision XT軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行記錄。
2. 結(jié)果
2.1 探索行為
研究分析了抗生素暴露96小時(shí)后斑馬魚的行為模式，結(jié)果表明，每種藥物至少有一種濃度測試會(huì)影響探索行為。所有抗生素藥物都會(huì)影響探索行為（圖1）。與對(duì)照組相比，接受25 mg/L環(huán)丙沙星、12.5 mg/L或25 mg/L頭孢他啶和12.5 mg/L金霉素的斑馬魚的游動(dòng)距離更長（圖1A）。研究還通過分析在水箱頂部/底部的時(shí)間來評(píng)估焦慮樣行為。結(jié)果表明，抗生素暴露后這些參數(shù)沒有差異（圖1B）。
圖1
2.2 Y迷宮試驗(yàn)
Y迷宮試驗(yàn)用于研究抗生素藥物對(duì)認(rèn)知的影響（圖2）。對(duì)照組表現(xiàn)如預(yù)期，與起始臂和其他臂相比，對(duì)照組在新臂上花費(fèi)了更多時(shí)間。然而，在所有濃度的環(huán)丙沙星（圖2A）、6.25和12.5 mg/L頭孢他啶（圖2B），以及12.5 mg/L和25 mg/L金霉素（圖2C）中，結(jié)果表明斑馬魚的記憶能力受損。
圖2
2.3 社交互動(dòng)
研究測量了斑馬魚在靠近其他魚類的區(qū)域內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間百分比和距離。結(jié)果顯示，這些參數(shù)都沒有改變。在斑馬魚中，沒有任何抗生素引起社交互動(dòng)障礙，所有接受實(shí)驗(yàn)的斑馬魚對(duì)刺激區(qū)表現(xiàn)出相同的偏好，如刺激區(qū)的時(shí)間百分比（圖3A）和刺激區(qū)的平均距離（圖3B）所示。
圖3
2.4 攻擊行為
我們觀察到抗生素在斑馬魚的攻擊性行為中起著作用。與對(duì)照組斑馬魚相比，接受環(huán)丙沙星處理的斑馬魚在離鏡子最近的部分停留的時(shí)間更長。經(jīng)過頭孢他啶處理過的產(chǎn)生了類似的效果（圖4C）。此外，環(huán)丙沙星和金霉素治療的動(dòng)物叮咬的行為次數(shù)顯著增加（圖4D）。接受抗生素處理的動(dòng)物呈現(xiàn)攻擊行為，而不僅僅是希望與鏡子中的圖像互動(dòng)。
圖4
3. 總結(jié)
本文研究表明，斑馬魚暴露于抗生素水生環(huán)境中會(huì)引起行為的改變，環(huán)丙沙星、金霉素和頭孢他啶抗生素造成的水環(huán)境改變可能會(huì)影響斑馬魚的探索、記憶和攻擊等行為，需要加強(qiáng)對(duì)抗生素污染可能會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物行為影響的重視和管理。
參考文獻(xiàn)
Petersen, Barbara Dutra, et al. "Antibiotic drugs alter zebrafish behavior." Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 242 (2021): 108936.
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